單寧酶

單寧酶除存在于富含單寧的植物中外，還廣泛存在于微生物中。能夠產(chǎn)生單寧酶的微生物來源十分豐富，主要是真菌類的曲霉屬、青霉屬和根霉屬，尤其是曲霉屬中的黑曲霉、米曲霉和黃曲霉；此外，酵母菌、寄生內(nèi)座殼菌、巴斯德菌、茄形鐮刀菌和綠色木霉等也可產(chǎn)生單寧酶。

單寧酶是一種糖蛋白，不同來源的單寧酶其分子量和糖鏈的含量有所差異，酶蛋白由2-8個單體聚合而成，糖基含量由12%到62%不等。不同來源的單寧酶溫度和pH穩(wěn)定性不同：最適溫度較高的50-60℃，一般在30-40℃之間，熱穩(wěn)定范圍在60-70℃以下；來源于真菌和植物的單寧酶的最適pH一般為4.0-6.0，pH穩(wěn)定性范圍一般是3.0-7.0之間，細菌單寧酶的最適pH一般偏中性。金屬離子對單寧酶活性的影響也有所不同：Libuchi S等發(fā)現(xiàn)許多離子對單寧酶無活化作用，但Zn和Ca可抑制酶活，另外EDTA溶液會使酶完全失活，而Aoki K等發(fā)現(xiàn)EDTA對酶活無明顯影響。Rajakumar G S等發(fā)現(xiàn)Cu，Zn，F(xiàn)e，Mg均對酶活力有顯著影響。郭魯宏等研究發(fā)現(xiàn)除了Mn，Zn抑制酶活之外，其它金屬離子對酶活均無明顯的激活或抑制作用。Kar B 等研究表明Mg、Hg可提高單寧酶活力，Ba、Ca、Zn、Hg、Ag會抑制酶活力，F(xiàn)e、Co完全抑制酶活。

單寧酶是一種誘導酶，可由微生物在單寧酸存在的條件下誘導產(chǎn)生的，目前對單寧酶發(fā)酵生產(chǎn)研究的重點多集中在曲霉和青霉上，常通過誘變育種選育和改良生產(chǎn)菌株以及通過優(yōu)化發(fā)酵條件等途徑來提高發(fā)酵產(chǎn)酶活力。如Libuchi等以Asp oryzae為出發(fā)菌株，以單寧酶為誘導物，探討了菌株產(chǎn)單寧酶的最適培養(yǎng)條件。Aoki K等以酵母屬的Candida spK-Ⅰ為出發(fā)菌株，以單寧為誘導物，探討了培養(yǎng)的最適條件，發(fā)現(xiàn)添加了3%的單寧所得的單寧酶積累量最多。Bradoo S等對產(chǎn)單寧酶的日本曲霉進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化，將酶活力提高了13%。龔加順等利用離子注入技術(shù)誘導得到一株單寧酶高產(chǎn)的9701菌株，其搖瓶培養(yǎng)的酶活力高達13.0l IU/ml，比出發(fā)菌株9401的酶活力高了2.89倍，且產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，重復性好；對另一株單寧酶高產(chǎn)菌株進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化后，獲得了53.58mo1/s的高產(chǎn)酶活力。王征等 對黑曲霉的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，獲得316U/m1的較高酶活力。劉如石等對黑曲霉NO.3菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，最高酶活力可達144.25U/100mL發(fā)酵液，酶比活力為17.71。近期余鈞池等采用先培養(yǎng)菌體后再誘導產(chǎn)酶的方式，在誘導劑濃度為1.5%，誘導培養(yǎng)基初始pH5.0，30℃培養(yǎng)48h的條件下，發(fā)酵米曲霉得到的單寧酶活力相當于167.4U/ml發(fā)酵液。

基因工程育種具有能定向、穩(wěn)定遺傳、目的性強、育種周期短和能克服遠緣雜交的障礙等優(yōu)點，國內(nèi)外都開展了構(gòu)建高產(chǎn)單寧酶基因工程菌的研究。Hatamoto O等克隆了米曲霉單寧酶的基因，用3個脫氧核糖核苷酸探針按照單寧酶N-末端和內(nèi)在的氨基酸序列合成了單寧酶基因。單寧酶低產(chǎn)菌株米曲霉AO1被包含單寧酶基因的質(zhì)粒pT1轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)化株的單寧酶活力增加了，且與轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒數(shù)成比例。陳志仕  克隆并分析了米曲霉單寧酶基因序列，構(gòu)建了含單寧酶基因的載體，實現(xiàn)了在大腸桿菌（E.coli）和畢赤酵母（Pichia pastoris）中的表達。鄭穗蘭改造了重組米曲霉單寧酶基因的表達質(zhì)粒，成功地進行了基因表達框架的改造，通過轉(zhuǎn)化篩選獲得了轉(zhuǎn)化子并進行了搖瓶表達的初步摸索。ZHONG X F 等研究了米曲霉單寧酶基因在畢赤酵母（Pichia pastoris）中的表達，酶活力比出發(fā)菌株提高了3倍。由于天然菌生產(chǎn)單寧酶主要是通過曲霉屬微生物的發(fā)酵獲得，曲霉屬發(fā)酵工藝成熟、易于大規(guī)模的培養(yǎng)、成本低廉、副產(chǎn)物少、產(chǎn)物分離簡單，人們也對利用重組曲霉表達系統(tǒng)提高單寧酶的表達進行了嘗試。如黃小鳳等 利用PCR擴增得到米曲霉單寧酶基因的編碼序列，然后將其連接到黑曲霉的表達載體ANED2-SP2上。將構(gòu)建好的單寧酶基因表達載體通過原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法導入黑曲霉菌株ST31中，該重組菌株的單寧酶活力最高為104.02U/ml，比原始天然菌株提高了2-3倍。Tadashi T等將外源的DNA整合到大豆曲霉和米曲霉的染色體中，提高了在ku70 和ku80 基因斷裂過程中基因的中靶頻率，為單寧酶基因的整合提供了參考價值。

單寧酶的生產(chǎn)可采用固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵兩種方法。雖然固體發(fā)酵的設備要求比較簡單，易于推廣，但其缺點是容易污染雜菌；而液體深層發(fā)酵比較容易控制，不易污染雜菌，而且生產(chǎn)效率高，目前單寧酶的研究和生產(chǎn)多采用液體深層發(fā)酵的方法。

在茶飲料的生產(chǎn)中，茶葉的高溫提取液冷卻后會變渾濁，并產(chǎn)生絮狀沉淀（茶乳酪）。茶葉提取液中固形物濃度越高，這種沉淀現(xiàn)象越嚴重，影響了茶飲料的穩(wěn)定。此外，茶飲料在冷藏中也會變得渾濁，滋味和香氣都會產(chǎn)生很大的影響，這種現(xiàn)象使其作為冷飲的商品價值受到很大的損害。茶飲料產(chǎn)生茶乳酪沉淀的原因是茶水中的咖啡因與兒茶素或者是以茶黃素等為核心形成的不溶性復合物，防止產(chǎn)生沉淀的方法包括原料茶葉的選擇、適當?shù)某樘釛l件、膜過濾處理、降低水溶性固形物的濃度等，也有采用添加PVPP進行處理。但不管是哪一個方法都會使茶葉的特有成分咖啡因和兒茶素類的含量下降，添加糖類雖然可抑制沉淀生成，但也存在增加熱量等問題。單寧酶是將茶乳酪轉(zhuǎn)溶的專一酶，它能斷裂兒茶酚與沒食子酸間的酯鍵，使苦澀味的酯型兒茶素水解，釋放出的沒食子酸陰離子又能與茶黃素、茶紅素競爭咖啡堿，形成分子量較小的水溶性短鏈物質(zhì)，從而降低茶湯的混濁度 。Takino Y利用米曲霉產(chǎn)生的單寧酶作用于6%的紅茶茶湯，發(fā)現(xiàn)單寧酶在茶湯pH 為5.6，溫度為45 ℃的條件下作用30-60分鐘后，茶乳酪產(chǎn)生最少。可口可樂公司利用單寧酶解決茶飲料中的“冷后渾”，取得了良好的效果，渾濁度由80%降至8%。對紅茶進行單寧酶處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)速溶茶完全溶于冷水，而且滋味良好，而無酶處理的茶的固形物和浸提物產(chǎn)量均低于酶處理的茶。日本專利J P3951260 報道：將提取物的溫度控制在單寧酶適宜溫度（20-80 ℃），添加酶量為每克干茶0.5～50單位，調(diào)整pH4.0～7.0，經(jīng)酶處理的茶湯用分子量不少于5000道爾頓的超濾膜過濾，再經(jīng)反滲透濃縮后，冷凍干燥即得冷水可溶的速溶茶 。近年來由于透明塑料瓶的大量使用，飲料的透明度比以往有更高的要求，單寧酶防止茶飲料產(chǎn)生冷渾濁的作用效果更加受到關注。

中森薰等 發(fā)現(xiàn)，與未用單寧酶處理的茶葉提取液相比，用單寧酶處理的提取液中，單寧的含量增加34%，咖啡因增加43%，而可溶性固形物也增加了24%，因而從茶葉提取出的多種成分能保持在提取液中，不被沉淀，使茶葉的提取率大幅度上升。單寧酶應用于紅茶、綠茶、烏龍茶深加工中, 還能使茶葉中可溶性金屬元素含量增加。Lauren S.等報道，用單寧酶處理紅茶，茶湯中可溶性鐵、鈣的含量分別增加了23%與15%；若在綠茶加工中使用單寧酶，可使離子鐵的含量提高18%，并部分消除夏春茶的苦澀味，提高茶品質(zhì)。Jakson 和Lee研究報道，添加單寧酶處理茶湯，茶中的鐵、鈣、鎂和鋅等離子的溶解性會增加。單寧酶還可用以輔助茶葉抗氧化劑來對抗食品氧化，如Mai J等報道用單寧酶處理的紅茶水浸出物其抗氧化能力得到增強。

通常茶飲料由于浸出后產(chǎn)生沉淀，就會使提取液中的固形物濃度下, 降而色澤變淡。單寧酶的作用提高了茶成分的得率，就能防止這種現(xiàn)象的發(fā)生。同時，由于茶葉中所含的咖啡因、維生素、兒茶素類物質(zhì)具有多種生理功能，例如茶多酚類的抗氧化作用、抗菌作用等，通過單寧酶處理，提高茶葉有效成分的得率，也就提高了其功能性。美國斯福冰茶公司研究認為，在加工速溶紅茶的提取工序之前，將紅茶先用單寧酶和纖維素酶的溶液噴灑，然后將茶葉放入封閉系統(tǒng)中放置一段時間，不僅可提高原料的制取率，增加可溶性物質(zhì)的含量，而且還能減輕一些苦澀味，增加茶葉的香氣。在綠茶、烏龍茶加工中的應用研究中也發(fā)現(xiàn)，加入一定量的單寧酶能降低酯型兒茶素的含量，從而消除夏秋茶的部分苦澀味道。