木瓜蛋白酶

番木瓜未成熟果實中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B ) 等多種蛋白水解酶。且已知四種半胱氨酸蛋白酶的一級結(jié)構(gòu)具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶屬巰基蛋白酶，可水解蛋白質(zhì)和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基端，并能優(yōu)先水解那些在肽鍵的N-端具有二個羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽鍵。

木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，分子量為23406，由一種單肽鏈組成，含有212個氨基酸殘基。至少有三個氨基酸殘基存在于酶的活性中心部位，他們分別是Cys25、His159和Asp158，當Cys25被氧化劑氧化或與金屬離子結(jié)合時，酶的活力被抑制，而還原劑半胱氨酸（或亞硫酸鹽）或EDTA能恢復(fù)酶的活力 。另外六個半胱氨酸殘基形成了三對二硫鍵,且都不在活性部位。純木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，約占可溶性蛋白質(zhì)的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，約占可溶性蛋白質(zhì)的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，約占可溶性蛋白質(zhì)的20%；及纖維素酶等不同的酶。

木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、堿性環(huán)境下均能分解蛋白質(zhì)的蛋白酶。它的外觀為白色至淺黃色的粉末，微有吸濕性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液為無色或淡黃色，有時呈乳白色；幾乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有機溶劑。木瓜蛋白酶是一種含巰基(-SH)肽鏈內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的水解能力，但幾乎不能分解蛋白胨。

木瓜蛋白酶的最適合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性時亦有作用，等電點（pI）為8.75；木瓜蛋白酶的最適合溫度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐熱性強，在90℃時也不會完全失活；受氧化劑抑制，還原性物質(zhì)激活。

木瓜蛋白酶的剪切肽鍵的機制包括：在His-159作用下Cys-25去質(zhì)子化，而Asn-158能夠幫助His-159的咪唑環(huán)的擺放，使得去質(zhì)子化可以發(fā)生；然后Cys-25親核攻擊肽主鏈上的羰基碳，并與之共價連接形成酰基－酶中間體；接著酶與一個水分子作用，發(fā)生去酰基化，并釋放肽鏈的羰基末端。

《GB 2760-2011 食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規(guī)定，木瓜蛋白酶可用作食品工業(yè)在的加工助劑（酶制劑）。一般應(yīng)在制成最后成品之前除去（規(guī)定有殘留量者除外）。

木瓜蛋白酶主要用于啤酒抗寒（水解啤酒中的蛋白質(zhì)，避免冷藏后引起的渾濁）、肉類軟化（水解肌肉蛋白和膠原蛋白，使肉類軟化）、谷類預(yù)煮的準備、水解蛋白質(zhì)和肉類香料的生產(chǎn)。在啤酒抗寒和肉類軟化方面的應(yīng)用遠比其他蛋白酶類廣泛。用量一般為1～4mg/kg促使餅干中面筋的分解，以使成品松軟。肉類軟化有多種蛋白酶可用，比較如下表所列。

通過測定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力大小，可判斷嫩肉粉質(zhì)量優(yōu)劣的參考依據(jù)：把嫩肉粉溶于鹽酸半胱氨酸溶液，取該混合液與酪蛋白溶液反應(yīng)10min，用紫外分光光度法測得反應(yīng)所生成酪氨酸的含量。該方法具有較好的準確性和重現(xiàn)性。以每分鐘水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需樣品的量為1個酶活力單位。 

在中國，木瓜種植主要分布在廣西的橫縣和邕寧縣等地，屬于廣西特產(chǎn)水果，因此，木瓜蛋白酶生產(chǎn)廠家主要集中在廣西南寧市，木瓜蛋白酶的生產(chǎn)和研究有將近20年的時間。

由木瓜的未成熟果實，經(jīng)提取乳液、凝固、沉降、干燥而成粗制品。一般工業(yè)上以粗制品的應(yīng)用為主。木瓜蛋白酶韻生產(chǎn)方法有三種，分別是直接熱風(fēng)烘干法、噴霧干燥法及膜分離凍干法。

生產(chǎn)方法較簡單、快速，但生產(chǎn)出來的成品只是粗酶，雜質(zhì)多、色澤差且微生物超標，酶活力也較低，只有60萬～80萬單位/g。多為個體工廠采用，已不能滿足國內(nèi)食品質(zhì)量衛(wèi)生安全等。

此法是先通過離心去除部分雜質(zhì)后再進行噴霧干燥，所生產(chǎn)出的成品酶活力相對高，達到100萬單位/g左右，雜質(zhì)相對也較少，色澤相對也較白。但產(chǎn)品噴霧時容易粘壁，酶活損失較大，水溶性相對也較差，而且酶活穩(wěn)定性也較差。

該生產(chǎn)方法不但避免了以上兩種方法的缺點，且生產(chǎn)過程衛(wèi)生安全，收率也高，所生產(chǎn)的成品酶活損失小，酶活力一般可達到280萬～350萬單位/g，最高可達400萬單位/g，且酶活穩(wěn)定性好，純度高，色澤潔白，細菌數(shù)低，嚴格操作可達到醫(yī)藥級別。

其提取工藝條件為超聲波功率300W，超聲處理時間200s，果漿質(zhì)量分數(shù)30%；經(jīng)超聲波強化提取，酶活力提高到原先的1.71倍；該酶在40℃以下，pH為5.4～6.0時酶活力相對穩(wěn)定；EDTA、Cys和維生素C對酶活力具有激活作用，CuS04和ZnCl2具有抑制作用，而KCl、NaCI、CaCl2、MgS04對酶活力的影響不大。

木瓜蛋白酶的分離純化工藝：采用初步采集處理，20%、40%硫酸銨分級沉淀、SP-sephadexC50柱色譜、羥基磷灰石柱色譜，從番木瓜乳汁中分離純化木瓜蛋白酶。可獲得比活為1184U/mg的純酶，活力回收率為55.79%，純度達到99.31%，為高純度的木瓜蛋白酶。

本方法僅適用于木瓜蛋白酶。

木瓜蛋白酶能使N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（底物）水解而釋出N-苯甲酰-L-精氨酸，其釋出量可用氫氧化鈉液滴定，以此確定酶活力。

在25℃下，每分鐘內(nèi)能催化分解1umol底物的酶量，稱為1單位。

1、底物溶液：準確稱取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽1.42g，加10mmol/LEDTA、50mmol/L半胱氨酸液2.6mL，加適量水，用0.1mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH至6.2，最后定容至50.0mL。

2、待測酶液：取試樣用水稀釋至適當濃度，并調(diào)節(jié)至pH6.2。

25℃恒溫條件下，取25mL燒杯裝在pH自動滴定儀上，加底物溶液3.75mL、3mol/L氯化鈉溶液2.50mL、重蒸餾水1.25mL，混合后加入待測酶液后立即計時，用0.1mol/L氫氧化鈉在電磁攪拌下連續(xù)滴定以保持pH6.2，記下每分鐘所耗0.01mol/L氫氧化鈉毫升數(shù)。同時進行空白校正。按下式計算木瓜蛋白酶的活力P（單位/mg）：

P =C·ΔV·1000/W

式中：c：氫氧化鈉液的濃度，mol/L；ΔV：每分鐘消耗氫氧化鈉液的體積減去空白值；W：反應(yīng)液中木瓜蛋白酶的質(zhì)量，mg。

木瓜蛋白酶在醫(yī)藥、食品、飲料、化學(xué)試劑、飼料、紡織化妝品等方面都有廣泛的應(yīng)用，開發(fā)前景廣闊。

在食品行業(yè)中，木瓜蛋白酶可用于肉類嫩化、啤酒澄清、餅干松化等用途。 

啤酒澄清劑

引起啤酒冷藏混濁時主要原因是啤酒中的蛋白質(zhì)極易與多元酚結(jié)合成大分子的復(fù)合物。利用啤酒澄清劑中的木瓜蛋白酶對形成混濁的蛋白質(zhì)有廣泛的特異性，能把大分子的蛋白質(zhì)降解成小分子的物質(zhì)，提高了蛋白質(zhì)與多元酚復(fù)合物的溶解度；另一方面，木瓜蛋白酶是一種具有生物活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可與引起啤酒冷藏混濁的多元酚形成穩(wěn)定狀態(tài)平衡，防止了啤酒的冷藏混濁。

肉類嫩化劑

利用木瓜蛋白酶能裂解肉類中的膠原蛋白和肌肉纖維，而使肉的結(jié)構(gòu)松散。由于木瓜蛋白酶是半胱氨酰基蛋白酶，能降解膠原纖維和結(jié)締組織蛋白質(zhì)，它將肌動球蛋白和膠原蛋白降解成為小分子的多肽甚至氨基酸, 令肌肉肌絲和筋腰絲斷裂, 使肉類變得嫩滑，并簡化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)使人體食用后易于消化吸收。

餅干松化劑

利用木瓜蛋白酶的酶促反應(yīng), 將面團的蛋白質(zhì)降解為小分子的膚或氨基酶, 降低了面團的拉伸阻力, 使面團變得柔軟、更有可塑性, 減少彈性, 易于成型。用量視餅干廠的加工方法和面團中蛋白質(zhì)的含量不同而不同，研究表明每公斤面添加0.6-1.0萬單位/ 克為佳。

木瓜蛋白酶可用于細胞培養(yǎng)實驗，在準備細胞培養(yǎng)液（cellculture）的第一步中被用于分離細胞。用酶處理小組織塊10分鐘后，就可以將連接細胞的細胞外基質(zhì)打斷；然后再用蛋白酶抑制劑來停止反應(yīng)，防止木瓜蛋白酶進一步裂解細胞本身；最后用Pasteurpipette將組織塊打散為單細胞懸浮液。

在免疫學(xué)中，木瓜蛋白酶可被用于將免疫球蛋白（即抗體）的Fc片段（可結(jié)晶）和Fab片段（抗原結(jié)合）切割開。

S22 Do not breathe dust.

切勿吸入粉塵。

S24 Avoid contact with skin.

避免皮膚接觸。

S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.

不慎與眼睛接觸后，請立即用大量清水沖洗并征求醫(yī)生意見。

S36/37 Wear suitable protective clothing and gloves.

穿戴適當?shù)姆雷o服和手套。

R36/37/38 Irritating to eyes, respiratory system and skin.

刺激眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚。

R42 May cause sensitization by inhalation.

吸入可能致敏。